等电聚焦电泳色谱仪的载体两性电解质

等电聚焦电泳色谱仪是在电泳介质中放入载体两性电解质，当通以直流电时，载体两性电解质形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，不同的蛋白质移动到其相当的等电点位置上，聚焦于一个狭窄区带中的过程。载体两性电解质是一系列脂肪族多氨基多羧酸同系物和异构体组成的混合物，具有很多既不相同又十分接近的相互连接的pH值，pH = 3～10。

一、理想的载体两性电解质应具备的特征：

1、分子量要小，易与被分离大分子物质分离。

2、化学性质稳定。

3、各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好的缓冲能力。

4、在pI处具有足够的电导，导电性均匀。

5、载体两性电解质的数目要足够多。

6、可溶性好。

7、对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度，不干扰样品的测定。

二、载体两性电解质pH梯度的形成：

载体两性电解质是一系列不同分子的两性电解质组成的混合物，通电后，它们将各自迁移到适当位置而形成一个连续的pH梯度。

1、没通电时的变化：

所有的载体两性电解质分子都荷电，只是溶液中荷正电和荷负电的基团数目相等，净电荷为零。

2、引入电场时的变化：

载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，带有低pI的分子（荷多的负电）将快地向阳极迁移。当它达到净电荷是零的位置时才停止。一些低pI的载体两性电解质分子（荷其次多的负电）也将向阳极移动，直到它的净电荷被减少到零时才停止。

在电解槽中，通电后正负两极都发生电极反应：

正极端反应：6H2O → O2 + 4H3O+ + 4eˉ

负极端反应：4H2O + 4eˉ→ 2H2 + 4OHˉ

在负极引起pH值升高，在正极引起pH下降，在电极槽的正极端放的是酸性溶液，负极端放的是碱性溶液，造成了在电极附近pH的急剧变化。由于载体两性电解质是一系列不同分子的两性电解质组成的混合物，设其中某一成分A的pI = pH′，当环境中的pH＞pH′时，它带负电荷，朝正极移动。当环境pI＜pH′时，它带正电荷，朝负极移动，直至移动到它的等点电处才停止。由于A在它的pI处具有一定的缓冲能力，在它附近形成一个pH稳定区域。同样，载体两性电解质中各种两性电解质也会各自迁移到它们的等电点处，由于它们的数量足够多，各自的等电点相差很小，从而形成一个pH梯度。

假设在一个系统中含有极多有适当的等电点和它的等电点处有一定缓冲能力的载体两性电解质，则形成的pH梯度是连续平滑的。

三、载体两性电解质pH梯度的选择：

在测定未知蛋白质时，可先采用pH = 3～10的载体两性电解质，经初步测定后改用较窄的以提高分辨率。