恒远技术员为客户解说ELISA不显色原因

据客户郑老师提出的技术问题，上海恒远公司技术员解说出ELISA不显示的原因，我公司将重点内容整理出，在这里分享给各位，希望能够给您的ELISA试剂盒实验带来帮助。

问题描述：以前是空白值太高，现在是所有的孔读值都在0.09左右(空白孔也是)，哪里都检查了，不知道是哪一步错了。我的步骤是这样的： 采用间接ELISA检测抗血清效价。 用pH 9.6, 0.15 mol.L-1的碳酸盐缓冲液将纯化的重组蛋白稀释为8、2、0.5μg·mL -1 , 包被酶标板, 每孔100μL, 4℃包被过夜。次日每孔加入100μL 7%的山羊血清封闭液, 37℃封闭2h后, 用PBST洗涤3次。然后每孔加入400、800、1600、3200倍稀释的羊抗血清100μL, 空白对照为兔抗血清稀释液( BSA+PBS)，37℃孵育1 h后，同上洗涤3次。再次每孔加入100μL HRP标记的羊抗人IgG, 37℃孵育30 min后, 同上洗涤3次。接下来每孔加入100μL TMB显色液, 37℃避光反应15 min后, 每孔再加入50μL终止液。最后，在酶标仪上测450 nm下的OD值。 不显色(几乎没有蓝色），后来用以前的ELISA试剂盒剩下的TMB，就显色，TMB是新的，没有问题，而且我用二抗加TMB后反应蓝色，这应该是TMB和二抗都没有问题吧？真不知道是哪里的原因了。

恒远技术：请问您包被的重组蛋白是人源的？如果是人源的，那么您加的二抗是羊抗人，这样测得的结果是不是不准确。间接法的二抗似乎应该和您的待测抗体结合。所以是不是应该选择HRP标记的X抗羊抗体？

郑老师：我不太理解您的意思，我做的包被的重组蛋白是人源的，待测抗体是lgG类的，二抗是抗lgG的HRP标记的抗体。

恒远技术：您做的是间接法，包被抗原是人源，待测抗体是羊源抗人，那么酶标二抗应该与待测抗体结合而不是包被的抗原，所以应该是其他种属抗羊抗体。因为看了您的叙述我感觉您的抗体种属可能有问题。本底太高是不是封闭液有问题。换BSA或者脱脂奶粉可以试一下。

郑老师：嗯，我前面可能叙述有误，待测抗体是人血清中的抗体。谢谢您的解答!

恒远技术：不用谢！

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